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2马银花愈伤组织RoWUS基因及其启动子的克隆与阐

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杜鹃花是一种主要的抚玩动物,具有必然的园林绿化及药用价值。本尝试室曾经对多种杜鹃花的组织培育进行了一系列研究,正在前人研究的根本上,本研究以马银花(Rhododendron ovatum Planch.)和满山红(Rhododendron simsii)试管苗为材料,对马银花的离体繁衍进行研究,并对满山红的离体繁衍系统进行优化;同时以马银花愈伤组织为材料,对动物干细胞相关基因RoWUS和RoCLV1的cDNA全长序列以及RoWUS基因的gDNA及启动子序列进行克隆,并操纵及时荧光定量PCR手艺对RoWUS和RoCLV1基因正在马银花愈伤组织分歧培育阶段以及分歧激素处置下的表达程度进行定量表达阐发。次要成果如下: 1马银花等杜鹃花离体繁衍系统的优化 以马银花和满山红试管苗为材料,对马银花试管苗的增殖、生根以及叶片愈伤组织的进行研究,并优化满山红试管苗增殖、生根系统。①比力分歧根基培育基、ZT、NAA、TDZ对马银花和满山红增殖的影响,正交试验成果表白:WPM+ZT2.0mg/L+NAA0.1mg/L+TDZ0.5mg/L对马银花试管苗增殖结果最佳,增殖系数最高,达到12.92,平均株高为1.89cm,叶片较大,茎粗壮,呈深绿色;WPM+ZT4.0mg/L+NAA0.2mg/L+TDZ1.0mg/L对满山红试管苗增殖结果最佳,增殖系数最高,达到8.27,平均株高为1.73cm,叶片大,茎新鲜粗壮,呈嫩绿色。②比力分歧根基培育基、NAA.IBA.AC对马银花和满山红生根的影响,正交试验成果表白:1/4WPM+IBA1.0mg/L+NAA0.0mg/L+AC3.0g/L对马银花试管苗生根影响最佳,平均根数最多为9.86条,平均根长为1.83cm;1/4WPM+IBA1.0mg/L+NAA0.0mg/L+AC3.0g/L对满山红试管苗生根影响最佳,生根率达到100%,平均根数最多为10.71条,平均根长为1.52cm。③比力分歧根基培育基、ZT、NAA、2,4-D对马银花叶片愈伤组织的影响,正交试验成果表白:WPM+ZT1.0mg/L+NAA0.15mg/L+2,4-D1.0mg/L对马银花愈伤组织结果最佳,率为62.22%,愈伤组织浅绿色、松散,发展情况优秀,所需时间最短。 2马银花愈伤组织RoWUS基因及其启动子的克隆取阐发 采用同源克隆法连系RACE手艺从马银花愈伤组织中克隆获得RoWUS cDNA全长序列,登录号为KF365488。马银花RoWUS cDNA全长1123bp,此中5-UTR长度为101bp,3-UTR长度为94bp,以ATG为起始暗码子,TAA为终止暗码子,Poly(A)尾长18bp,编码302个氨基酸。RoWUS卵白相对量为33422.5Da,理论等电点(pI)5.81,式为C1444H2186N416O477S13,亚细胞定位于细胞核的可能性最高,是不不变的亲水卵白,无信号肽,具有跨膜布局,包含homeodomain功能位点。二级布局预测表白该卵白以无法则卷曲布局为从,所占的比例为74.83%,其次为α螺旋布局占15.23%,延长链所占的比例较少,为9.93%。由三维布局预测可知,该卵白的次要布局元件是无法则卷曲、α螺旋和延长链,取二级布局预测成果相符。系统进化树阐发表白RoWUS零丁构成一个分支,取葡萄、大豆和苜蓿的亲缘关系比来。 采用同源克隆法连系RACE手艺从马银花愈伤组织中克隆获得RoWUS gDNA序列,序列长2001bp,包含2个内含子和3个外显子,3个外显子正在DNA序列上的位点别离是1-370;831-946;1579-2001。 采用染色体步移法从马银花愈伤组织中克隆获得RoWUS基因的启动子序列,启动子长3122bp,登录号为KF861578。焦点启动子区域预测成果表白RoWUS启动子具有多个焦点启动子区域,此中最可能的焦点启动子区域为GTCGTTCATATATATATTTATGCCCGATCAAT CTGATTTTTCTCTGCGAT,可能的起始位点位于翻译起始位点上逛-1381bp处的T(将起始暗码子ATG中的A定义为位+1)。该启动子中焦点元件TATA-Box有57个、CAAT-Box有27个,别的还含有多个光响应元件、顺境响应元件、激素应对元件和其他功能元件。 3马银花愈伤组织RoCLV1基因的克隆取阐发 采用同源克隆法连系RACE手艺从马银花愈伤组织中克隆获得RoCLV1cDNA全长序列,登录号为KF861577。马银花RoCLV1cDNA全长3526bp,此中5-UTR长度为169bp,3-UTR长度为363bp,起始暗码子为ATG,终止暗码子为TGA, Poly(A)尾长8bp,编码992个氨基酸。RoCLV1卵白相对量为109589.3Da,理论等电点(pI)8.62,式为C4933H7845N1317O1437S31, RoCLV1卵白亚细胞定位于细胞质膜的可能性最高,具有信号肽和跨膜布局,是不不变的亲水卵白,含有Pkinase和PROTEIN_KINASE_DOM布局域。二级布局预测表白RoCLV1卵白以无法则卷曲为从,所占的比例为51.71%,其次为α螺旋布局占33.77%,延长链所占的比例较少,为14.52%。由三维布局预测可知,该卵白的次要布局元件是无法则卷曲、a螺旋和延长链,取二级布局预测成果相符。系统进化树阐发表白马银花RoCLV1取葡萄亲缘关系比来,构成一个分支,取草莓、碧桃、番茄、马铃薯等的亲缘关系较近。 4马银花愈伤组织发展过程中干细胞相关基因的定量表达阐发 以EF-1a为内参基因,用荧光定量PCR法对RoWUS和RoCLV1基因正在马银花愈伤组织分歧培育阶段及分歧激素处置下的表达环境进行阐发。试验成果表白:RoWUS和RoCLV1基因正在马银花愈伤组织分歧培育阶段均有表达,且无论是分歧继代周期仍是统一继代周期分歧中RoWUS的相对表达量都比RoCLV1的相对表达量要高,能够猜测正在马银花愈伤组织的发生过程中,RoWUS基因正在干细胞维持和分化的调控路子中可能起到主要感化,进而对愈伤组织的分化起主要调控感化。一个继代周期内分歧和分歧继代周期中RoWUS基因的表达量变化趋向类似。一个继代周期内RoWUS基因正在第25d时表达量最高,分歧继代周期中RoWUS基因正在第5代表达量达到峰值,而此时马银花愈伤组织布局松散,颜色浅而通明,申明该愈伤组织可能正在该期间处于细胞兴旺期。RoCLV1正在第10d、30d和45d时候呈现3个峰值,申明RoCLV1对马银花愈伤组织正在分歧时间的细胞有分歧的影响。 用赤霉素和零落酸处置马银花愈伤组织时RoWUS和RoCLV1基因的相对表达量变化趋向分歧。赤霉素浓度较低时RoWUS和RoCLV1基因的响应比力弱,可是跟着赤霉素浓度的提高,RoWUS和RoCLV1基因对赤霉素响应逐步加强,正在浓度为15mg/L时响应最强,浓度进一步添加时又降低。这可能是试验所用的培育基中含有活性较高的细胞素和必然浓度的发展素导致的。用低浓度ABA处置时RoWUS和RoCLV1基因相对表达量不变,可是当ABA浓度从10mg/L添加到15mg/L时RoWUS和RoCLV1基因相对表达量敏捷添加。申明此浓度范畴是RoWUS和RoCLV1基因中ABA元件响应的最佳浓度,能够推进愈伤组织细胞快速。用水杨酸处置时RoWUS的相对表达量较低,RoCLV1的相对表达量较高且变化较大,这可能是由于CLV1取WUS之间存正在较为复杂的调控关系。

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